Spektrofotometri er en eksperimentel teknik, der bruges til at måle koncentrationen af et opløst stof i en bestemt opløsning ved at beregne mængden af lys, der absorberes af det pågældende stof. Denne teknik er meget nyttig, fordi visse forbindelser også vil absorbere forskellige bølgelængder af lys ved forskellige intensiteter. Ved at analysere lyset, der passerer gennem en opløsning, kan du identificere forbindelserne opløst i opløsningen og deres koncentrationer. Værktøjet, der bruges til at analysere løsninger med denne teknik i laboratoriet, er et spektrofotometer.
Trin
Del 1 af 3: Forberedelse af prøven
Trin 1. Tænd for spektrofotometeret
De fleste spektrofotometre skal varmes op, før de kan give nøjagtige målinger. Så start maskinen og lad den sidde i mindst 15 minutter, før prøven måles.
Brug denne tid til at forberede prøven
Trin 2. Rengør kuvetten eller reagensglas
I skolelaboratorier er der muligvis disponible reagensglas, som ikke skal rengøres først. Men hvis du bruger en almindelig kuvette eller reagensglas, skal du rengøre apparatet grundigt før brug. Skyl alle kuvetter med deioniseret vand.
- Vær forsigtig med at bruge kuvetter, da de er ret dyre.
- Når du bruger kuvetten, må du ikke røre ved den side, hvor lyset passerer (normalt beholderens klare side).
Trin 3. Hæld tilstrækkelig prøve i kuvetten
Det maksimale volumen for en del af kuvetten er 1 ml, mens reagensglasets maksimale volumen er 5 ml. Dine målinger skal være nøjagtige, så længe spektrofotometerets lys stadig kan passere gennem prøven og ikke en tom del af beholderen.
Hvis du bruger en pipette til at indsætte prøver, skal du bruge et nyt tip til hver prøve. På den måde kan krydskontaminering undgås
Trin 4. Forbered kontrolopløsningen
Disse opløsninger, der også er kendt som emner eller emner, indeholder kun opløsningsmidlet i den opløsning, der skal analyseres. For eksempel, hvis du har en saltprøve opløst i vand, er den tomme opløsning, du har brug for, vand. Hvis vandet du bruger er rødt, skal du også bruge en rød blank løsning. Brug en lignende beholder til at holde den tomme opløsning i samme volumen som prøven.
Trin 5. Tør ydersiden af kuvetten
Inden kuvetten indsættes i spektrofotometeret, skal du sikre, at den er ren for at undgå forstyrrelser i målingerne på grund af støvpartikler eller urenheder. Brug en fnugfri klud til at fjerne vanddråber eller støv, der klæber til ydersiden af kuvetten.
Del 2 af 3: Eksperimentering
Trin 1. Bestem og juster lysets bølgelængde for at analysere prøven
Brug en enkelt lysbølgelængde (monokromatisk stråle) for at øge måleeffektiviteten. Vælg den lysfarve, der kan absorberes af det kemiske indhold, der menes at være opløst i testprøven. Indstil bølgelængden i henhold til specifikationerne for det spektrofotometer, du bruger.
- I skolelaboratorier vil disse bølgelængder normalt være angivet i de eksperimentelle instruktioner.
- Fordi prøven vil reflektere alt synligt lys, er bølgelængden af det eksperimentelle lyss farve normalt altid forskellig fra prøvens farve.
- Et objekt viser en bestemt farve, fordi det afspejler en bestemt bølgelængde og absorberer alle andre farver. Græs fremstår grønt, fordi klorofylet i det afspejler grønt og absorberer andre farver.
Trin 2. Kalibrer spektrofotometeret med en blank opløsning
Læg den tomme opløsning i kuvetteholderen, og luk spektrofotometeret. På den analoge spektrofotometer skærm er der en nål, der vil bevæge sig baseret på intensiteten af lysdetektering. Når den tomme opløsning er indsat, skal nålen bevæge sig til højre. Registrer denne værdi, hvis du har brug for den senere. Lad den tomme opløsning forblive i spektrofotometeret, og skub derefter nålen til nul ved hjælp af justeringsknappen.
- Digitale spektrofotometre kan også kalibreres på samme måde. Dette værktøj er dog udstyret med en digital skærm. Indstil aflæsningen af den tomme løsning til 0 med betjeningsknappen.
- Selvom den tomme opløsning fjernes fra spektrofotometeret, er kalibreringen stadig gyldig. Så når du måler hele prøven, reduceres emnets absorbans automatisk.
Trin 3. Fjern emnet, og afprøv spektrofotometerets kalibreringsresultater
Selv efter at blindopløsningen er fjernet fra spektrofotometeret, skal nålen eller nummeret på skærmen stadig læse 0. Sæt den tomme opløsning tilbage i spektrofotometeret, og sørg for, at aflæsningen ikke ændres. Hvis spektrofotometeret er kalibreret korrekt ved hjælp af en tom opløsning, skal resultatet på skærmen stadig være 0.
- Hvis nålen eller nummeret på skærmen ikke læser 0, gentages kalibreringstrinnene med en tom opløsning.
- Hvis problemet fortsætter, skal du søge hjælp eller få nogen til at kontrollere spektrofotometeret.
Trin 4. Mål prøvens absorbans
Fjern den tomme opløsning, og indsæt prøven i spektrofotometeret. Vent cirka 10 sekunder, før hænderne stabiliseres, eller tallene på det digitale display holder op med at ændre sig. Registrer prøvens transmittans og/eller absorbans.
- Jo mere lys der passeres, jo mindre lys absorberes. Normalt skal du registrere absorbansværdien af prøven, der generelt udtrykkes som et decimaltal, for eksempel 0,43.
- Gentag målingen af hver prøve mindst tre gange, og bereg derefter gennemsnittet. På den måde bliver de resultater, du får, mere præcise.
Trin 5. Gentag forsøget med forskellige bølgelængder af lys
Din prøve kan indeholde flere forbindelser, der har forskellige absorbanser afhængigt af lysets bølgelængde. For at reducere usikkerhed skal prøverne måles ved 25 nm bølgelængdeintervaller på tværs af lysspektret. På denne måde kan du påvise andre opløste kemikalier i prøven.
Del 3 af 3: Analyse af absorbansdata
Trin 1. Beregn prøvens transmittans og absorbans
Transmittansen er, hvor meget lys der kan passere gennem prøven og nå spektrofotometeret. I mellemtiden er absorbans, hvor meget lys der absorberes af et af de opløste kemikalier i prøven. Der er mange moderne spektrofotometre, der giver output i form af transmittans og absorbans. Men hvis du får en lysintensitetsværdi, kan du også selv beregne disse to værdier.
- Transmittansen (T) kan bestemmes ved at dividere intensiteten af lys, der passerer gennem prøveopløsningen, med mængden af lys, der passerer gennem den tomme opløsning. Denne værdi udtrykkes normalt som et decimaltal eller en procentdel. T = I/I0, hvor jeg er prøveintensiteten og jeg0 er den tomme intensitet.
- Absorbans (A) udtrykkes som en negativ base 10 logaritme (eksponent) transmittans: A = -log10T. Så hvis T = 0, 1, A = 1 (0, 1 er 10 til effekten -1). Det betyder, at 10% af lyset passeres, mens 90% absorberes. I mellemtiden, hvis T = 0,01, A = 2 (0,01 er 10 til effekten -2). Det betyder, at det lys, der passeres, er 0,1%.
Trin 2. Tegn absorbansværdien kontra bølgelængden
Udtryk absorbansværdien som y-aksen og bølgelængden som x-aksen. Fra prikkerne for alle absorbansresultater i hver bølgelængde får du prøvens absorbansspektrum og identificerer forbindelsens indhold og dets forhold i prøven.
Absorbansspektre har normalt toppe ved bestemte bølgelængder. Disse maksimale bølgelængder giver dig mulighed for at identificere specifikke forbindelser
Trin 3. Sammenlign dit absorbansspektrum med en graf over en kendt forbindelse
Hver forbindelse har et unikt absorbansspektrum og har altid den samme spidsbølgelængde i hver måling. Ved at sammenligne den graf, du får med en graf over en bestemt kendt forbindelse, kan du identificere det opløste indhold i prøveopløsningen.
