Gramfarvning er en hurtig teknik og bruges til at se tilstedeværelsen af bakterier i en vævsprøve og til at klassificere bakterierne som gram-positive eller gram-negative baseret på de kemiske og fysiske egenskaber af deres cellevægge. Gramfarvning bruges næsten altid som det første trin i diagnosticering af en bakteriel infektion.
Denne farvningsteknik er opkaldt efter den danske videnskabsmand Hans Christian Gram (1853 - 1938), der udviklede teknikken i 1882 og udgav den i 1884 som en teknik til at skelne mellem to typer bakterier med lignende kliniske symptomer: Streptococcus pneumoniae (også kendt som Streptococcus pneumoniae). Pneumococci) og bakterierne Klebsiella pneumoniae.
Trin
Metode 1 af 3: Forberedelse af objektglas
Trin 1. Forbered dig på at arbejde i laboratoriet
Brug handsker og et langt hår slips for at forhindre bakteriel kontaminering af den prøve, du tester. Rengør arbejdsområdet under en stinkskab eller i et andet godt ventileret område. Kontroller Bunsen -brænderen, og kontroller, at mikroskopet fungerer korrekt, før du starter.
Trin 2. Steriliser mikroskopglasglaset
Hvis glasset er snavset, vask det med sæbevand for at fjerne olie og snavs. Rengør diasene med ethanol, glasrens eller en anden metode, der bruges af dit laboratorium.
Trin 3. Læg prøven på glasset
Du kan bruge Gram -farveteknikken til at hjælpe med at identificere bakterier i en medicinsk prøve eller en kultur af bakterier, der vokser i en petriskål. For de bedste resultater skal du bruge Gram -farvning på tynde streger af prøven. Det tilrådes at bruge prøver, der er mindre end 24 timer gamle, da ældre bakterier kan have beskadiget deres cellevægge og muligvis ikke reagere på Gram -farvning.
- Hvis du bruger en vævsprøve, tilsættes 1-2 dråber til et glasglas. Spred jævnt på objektglasset for at danne et tyndt lag prøvesprinkling ved at skubbe det ved hjælp af kanten af det andet sterile glasglas. Lad det tørre, inden du gør det næste trin.
- Hvis du tager bakterier fra en petriskål, skal du sterilisere inokulationssløjfen i en Bunsen -brænder, indtil den lyser, og lad den derefter afkøle. Brug løkken til at dryppe sterilt vand på diaset, steriliser derefter og afkøl igen, før du bruger det til at opsamle en lille prøve af bakterier. Derefter omrøres forsigtigt.
- Bakterierne, der er fremstillet i bouillonen, skal omrøres igen ved hjælp af en vortexer og derefter tages med inokulationssløjfen som ovenfor uden tilsætning af vand.
- Hvis du har en vatpindeprøve (normalt udført med et lille håndtag med bomuldstip), skal du røre og dreje forsigtigt vatpinden hen over diaset.
Trin 4. En lidt høj temperatur kan give en god smøre
Varmen holder bakterierne oven på objektglasset, så de ikke opløses let under farvningsprocessen. Bank hurtigt på diaset to til tre gange over en Bunsen -brænder, eller varm objektglasset op over en elektrisk glidevarmer. Overophed ikke, prøven kan blive beskadiget. Hvis du bruger en Bunsen -brænder, bør det være en lille, men blå flamme i stedet for en stor orange flamme.
Alternativt kan der også laves en udstrygning med methanol ved at tilsætte 1-2 dråber methanol til en tør udstrygning, tørre den resterende methanol på objektglasset ved at lade den stå i det fri. Denne teknik minimerer celleskader og giver en ren diasbilledbaggrund
Trin 5. Placer objektglasset over farvebakken
Farvningsbakker er lavet af metal-, glas- eller lavvandede plastplader med et blødt net, der forer toppen. Placer diasene oven på disse net, så den væske, du bruger, kan tømmes i bakken.
Hvis du ikke har en farvebakke, kan du placere et dias på en plastbakke for at printe isterninger
Metode 2 af 3: Gramfarvningsproces
Trin 1. Hæld den krystalviolette væske over udstrygningen
Brug en pipette til at sprøjte en prøve af bakterier med et par dråber krystalviolet farvestof, også kendt som gentianviolet. Lad det stå i 30-60 sekunder. Krystalviolet (KV) separerer i vandig opløsning i KV+ og chlorid (Cl-) ioner. Disse ioner trænger ind i cellevæggene og cellemembranerne af både grampositive og gramnegative bakterier. KV+ -ionen interagerer med de negativt ladede komponenter i bakteriecellerne, hvilket giver cellerne en lilla farve.
Mange laboratorier bruger "Hucker" krystalviolet, som indeholder ammoniumoxalat for at forhindre nedbør
Trin 2. Skyl krystalviolet forsigtigt
Vip objektglasset, og brug en skiveflaske til at sprøjte en lille strøm destilleret eller postevand over objektglasset. Vand skal løbe ned over overfladen af udstrygningen og må ikke sprøjtes direkte på udstrygningen. Skyl ikke for meget. Det kan fjerne farvning i grampositive bakterier.
Trin 3. Skyl udstrygningen med jod, og skyl derefter
Brug en dropper til at skylle udstrygningen med jod. Lad det sidde i mindst 60 sekunder, skyl derefter omhyggeligt på samme måde som ovenfor. Jod, i form af en negativt ladet ion, interagerer med KV+ for at danne et stort sammensat kompleks mellem krystalviolet og jod (CV-I-sammensat kompleks) i cellens indre og ydre lag. Dette kompleks af forbindelser vil bevare den violette farve af krystalviolen inde i cellen på de farvede steder.
Jod er et ætsende stof. Undgå indånding, indtagelse eller kontakt med huden
Trin 4. Tilsæt farveblegemiddel, og skyl derefter hurtigt af
En 1: 1 blanding af acetone og ethanol bruges normalt til dette vigtige trin, som skal omhyggeligt times. Placer objektglasset i en bestemt vinkel, og tilføj derefter farveblegemiddel, indtil der ikke er mere lilla synligt i vandet, der bruges til skylning. Dette tager normalt mindre end 10 sekunder eller endda kortere tid, hvis blegemidlet indeholder en høj koncentration af acetone. Stop dette trin med det samme, ellers vil farvestoffet også udvaskes krystalviolet fra de gram-positive og negative celler, og farvningsprocessen skal gentages. Skyl straks eventuelt overskydende farveblegemiddel ved hjælp af den tidligere teknik.
- Ren acetone (95%+) kan bruges som erstatning. Jo mere acetone du bruger, jo hurtigere virker blegemidlet, så du skal være mere opmærksom på timingen.
- Hvis du har problemer med at holde styr på tiden for dette trin, skal du tilføje farveblegemiddel dråbevis.
Trin 5. Drys modfarvestoffet ud over udstrygningen, og skyl derefter
En modfarvning, sædvanligvis safranin eller fuchsin, bruges til at øge kontrasten mellem gramnegative og grampositive bakterier ved at farve misfarvede (affarvede) bakterier, dvs. gramnegative bakterier, lyserøde eller røde. Lad i mindst 45 sekunder, skyl derefter.
Fuchsin vil intensivt plette mange gram-negative bakterier, såsom Haemophilus spp og Legionella spp. Denne metode er god for begyndere
Trin 6. Tør objektglasset
Du kan tørre dem i det fri for at tørre, eller tørre dem ved hjælp af papir, der sælges til dette formål. Gramfarvningsprocessen er fuldført.
Metode 3 af 3: Kontrol af farvestoffer
Trin 1. Forbered lysmikroskopet
Placer diaset under mikroskopet. Bakterier varierer meget i størrelse, så den samlede forstørrelse, der kræves, varierer fra 400x til 1000x. Et objektiv med nedsænket olie anbefales til et skarpere billede. Drop nedsænkningsolien på objektglasset, undgå bevægelse, mens det drypper for at forhindre bobler i at danne. Flyt mikroskoplinsens håndtag, så objektivet klikker på plads og rører olien.
Nedsænkning af olie kan kun bruges på specialdesignede linser, ikke på "tørre" linser
Trin 2. Prøv at identificere grampositive og gramnegative bakterier
Undersøg diaset under et lysmikroskop. Gram-positive bakterier fremstår lilla i farven, fordi krystalvioletten er fanget i den tykke cellevæg. Gram-negative bakterier vil være lyserøde eller røde i farven, fordi den krystalviolette skylles ud gennem de tynde cellevægge, hvor det lyserøde modfarvestof kommer ind.
- Hvis prøven er for tyk, kan resultatet være et falsk positivt. Plet en ny prøve, hvis den viser alle grampositive bakterier, for at sikre, at resultatet er korrekt.
- Hvis du bruger for meget farveblegemiddel, kan resultatet være et falsk negativt. Plet en ny prøve, hvis den viser alle gramnegative bakterier, for at sikre, at resultatet er korrekt.
Trin 3. Sammenlign de resultater, du ser, med referencebilledet
Hvis du ikke ved, hvordan bakterier ser ud, skal du studere samlingen af referencebilleder, normalt sorteret efter form og gramfarvning. Du kan også se onlinedatabaser på [National Microbial Pathogen Database, Bacteria in Photos og mange andre online -websteder. For at lette identifikationen er der nedenfor eksempler på bakterier, der ofte opstår eller er vigtige for diagnosen, klassificeret efter deres Gram -status og form.
Trin 4. Identificer grampositive bakterier baseret på deres form
Bakterier klassificeres yderligere efter deres form under mikroskopet, oftest som kokker (sfæriske) eller stænger (cylindriske). Her er nogle eksempler på grampositive bakterier (lilla i farven) i henhold til deres form:
- Gram positive cocci sædvanligvis stafylokokker (betyder gruppekokker) eller streptokokker (der betyder kædekokker).
- 'Grampositive stænger som Bacillus, Clostridium, Corynebacterium og Listeria. Stangbakterien Actinomyces spp. har normalt grene eller filamenter.
Trin 5. Identificer gramnegative bakterier
Gram-negative bakterier (pink i farven) klassificeres ofte i tre grupper. Cocci er sfæriske i form, stænger er lange og tynde, mens coccoidstænger er imellem.
- Gram negative kokker Den mest almindelige er Neisseria spp.
- Gram-negative stænger f.eks. E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas og mange andre. Vibrio cholerae kan ses som en almindelig stilk eller en bøjet stilk.
- Gram-negative "coccoid" (eller "coccobacilli") stangbakterier f.eks. Bordetella, Brucella, Haemophilus og Pasteurella
Trin 6. Kontroller omhyggeligt, om resultaterne er blandet
Nogle bakterier er vanskelige at farve præcist på grund af deres cellevægge sprødhed eller voksagtig karakter. Disse bakterier kan vise en blanding af lilla eller pink i den samme celle eller mellem forskellige celler i det samme udstrygning. Bakterieprøver ældre end 24 timer kan vise dette problem, men der er også nogle bakteriearter, der stadig er svære at farve i enhver prøveudtagningsalder. Disse bakterier kræver mere specialiserede test til identifikation, såsom syrehurtig farvning, observation i bakteriekultur, TSI-kulturmedier eller genetisk testning.
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium og Propionibacterium spp. alle er grampositive bakterier, men er ofte ikke tydeligt farvede.
- Små, slanke bakterier som Treponema, Chlamydia og Rickettsia spp. svært at plette ved Gram -metoden.
Trin 7. Bortskaf alle resterende forbrugsstoffer og udstyr
Denne bortskaffelsesprocedure varierer mellem laboratorier og afhænger af de anvendte materialer. Typisk bortskaffes væsken i farvningsbakken i flasker mærket som farligt affald. Blødgør dias i 10% blegemiddelopløsning, og smid derefter i en skarp beholder.
Tips
- Husk, at Gram -farvningsresultater kun vil være gode, hvis prøven er god. Det er vigtigt at informere patienterne, så de kan levere en god prøve (f.eks. Forskellen mellem spytte versus en dyb hoste for at få en sputumprøve).
- Som farveblegemiddel reagerer ethanol langsommere end acetone.
- Overhold standard laboratoriebestemmelser for at sikre sikkerheden.
- Brug en kindpind til at øve, fordi den indeholder både gram-positive og gram-negative bakterier. Hvis du kun ser en type bakterier, bruger du muligvis for lidt eller for meget blegemiddel.
- Du kan bruge trælåse til at fastgøre diaset.
Advarsel
- Acetone og ethanol er brandfarlige stoffer. Acetonen fjerner olien fra dine hænder, hvilket gør det lettere for din hud at optage andre kemikalier. Brug handsker og brug dem med forsigtighed.
- Lad ikke udtværingen tørre, før du skyller Gram -pletten af eller modfarverer.
Hvad du har brug for
- Netværksprøve
- Glasglas
- Pipette
- Lille ildkilde eller glidevarmer eller methanol
- Vand
- Krystalviolet
- Jod
- Farveblegemiddel, såsom alkohol eller acetone
- Safranin
